男科（CA）是主要由人乳头瘤病毒（HPV）引起的性传播疾病，近年来的研究发现，男科可能有异常的细胞凋亡。Fas是一种介导细胞凋亡的信号受体，可诱导靶细胞凋亡。FasL的作用是杀伤接近肿瘤的激发与抑制机制还不监控，干扰受感染细胞的凋亡，这是值得研究的课题。十分清楚，HPV如何逃避免疫本研究通过分析HPV感染对Fas系统表达的影响，探讨Fas/FasL在男科中的表达及与人乳头瘤病毒感染的关系。

 

　　1材料与方法

 

　　1.1研究对象

 

　　本院2012年1－12月泌尿外科性病门诊就诊的81例患者，根据卫生部疾病控制司制定的CA诊断标准确诊。男49例，女32例，年龄20～70岁。81例正常包皮组织（对照组）来自本院包皮环切术的健康男性，近期无局部感染和男科病史。

 

　　排除标准：患者免疫功能低下或长期服用免疫抑制剂；糖尿病患者；不能定期随访者。

 

　　1.2取材方法

 

　　暴露疣体，常规消毒，用血管钳摘取部分疣体组织，部分标本置入备有1mL生理盐水的无菌样本管中，标本存于－20℃冰箱待检。部分标本经10%中性甲醛室温固定、石蜡包埋、室温存放、实验时将标本制成4μm厚度的石蜡切片。

 

　　1.3试剂

 

　　HPV试剂盒采用中山医科大学达安基因诊断中心生产的HPV6/11型PCR荧光检测试剂盒。实验用的兔抗人Fas和FasL多克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司，工作浓度均为1∶200。

 

　　1.4仪器

 

　　美国PE公司生产的PE-5700荧光定量PCR仪、CO2激光仪、快速混匀器、高精度移液枪。

 

　　1.5方法

 

　　1.5.1DNA提取取出待测样本（组织需剪碎），置于室温下解冻，振荡混匀后取100μL于另一无菌的0.5mL离心管内，13000r/min离心10min，小心吸弃上清液，保留沉淀物，再向沉淀物内加入DNA提取液50μL，振荡混匀，100℃沸水浴100min，13000r/min离心10min，保留上清液待用。

 

　　1.5.2DNA抽提和PCR扩增

 

　　标本处理及HPV阳性标准品的稀释按试剂盒说明书操作。取单管单人份PCR反应管1支，加入处理后的标本或阳性标准品2μL，8000r/min离心数秒，将各反应管放入PCR仪的反应槽内，按对应顺序设置阴性对照、阳性标准品梯度　　及未知标本，采用热启动法扩增。扩增条件：93℃预变性2min，93℃45s，55℃60s，10个循环；93℃30s，55℃45s，30个循环。计算机分析，确定基线和阈值，建立标准曲线，读取并计算各管的DNA含量。

 

　　1.5.3免疫组织化学染色（EnVision）法

 

　　按试剂盒说明书步骤操作，PBS代替一抗作阴性对照。

 

　　1.5.4结果判断Fas和FasL

 

　　阳性反应定位于胞膜和胞浆，为棕黄色反应。随机计数10个高倍视野下的上皮细胞数，计数阳性细胞所占的比例，阳性细胞数≥10%为阳性表达。

 

　　1.6治疗方法及疗效判定标准

 

　　对所有病例均采用CO2激光去除，伤口愈合后外用干扰素，每2周复查1次，随访3个月。肉眼疣体消失，无新发疣体出现为治愈，在原皮损处或邻近部位有新疣体出现者为复发。

 

　　1.7统计学处理

 

　　采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

 

　　2结果

 

　　2.1男科组织中HPV6/11定量结果

 

　　见图1。在81例CA中，HPV6/11型检出阳性77例，阳性检出率为95.06%（另4例可能为其他型），HPV6/11型高载量组67例（82.72%），低载量组10例（12.35%）；男科初发组41例，复发组40例。DNA载量在男科初发组中及男科复发组的组织中分别为（2.31×103～3.72×104）copies/mL和（4.63×104～1.7×106）copies/mL，两组比较差异有统计学意义（t=－28.541，P＜0.001），即在男科组织中复发组病毒载量高于初发组。

 

 

　　2.2男科组织中Fas和FasL的表达

 

　　见表1，图2～3。Fas/FasL阳性反应定位于胞膜和胞浆，为棕黄色反应。在男科和阴茎包皮环切组织中Fas表达阳性率差异有统计学意义（χ2=39.506，P＜0.001）；FasL在两组之间阳性率差异有统计学意义（χ2=27.305，P＜0.001）。

 

表1    男科组与正常对照组Fas/FasL表达阳性率的比较

 

　　2.3男科组织

 

　　HPV感染与Fas/FasL表达的关系见表2。男科HPV高载量组和HPV低载量组Fas表达阳性率差异有统计学意义（χ2=7.297，P＜0.05），FasL在两组之间差异有统计学意义（χ2=9.749，P＜0.05）。

 

表2    HPV DNA低载量组与高载量组Fas/FasL表达阳性率的比较